細(xì)胞牽張培養(yǎng)結(jié)合熒光染色技術(shù)

細(xì)胞機(jī)械刺激培養(yǎng)后的熒光染色

活細(xì)胞中水的比例高，其結(jié)構(gòu)通常是透明的。研究者通過使用不同染色劑可以優(yōu)先染色某些部分，或觀察細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)。例如細(xì)胞核、細(xì)胞壁，或整個細(xì)胞。

幾乎所有機(jī)械傳導(dǎo)研究的驅(qū)動目標(biāo)都是細(xì)胞對機(jī)械刺激的生化反應(yīng)。因其往往伴隨著細(xì)胞骨架和形態(tài)的變化，有效使用細(xì)胞熒光染色技術(shù)可以對細(xì)胞信號進(jìn)行重要的定性和定量觀察。

然而，體外牽張培養(yǎng)使用的PDMS柔性基底膜可能會帶來新的挑戰(zhàn)，特別是與通常使用的培養(yǎng)皿或玻片相比。

拉伸膜是否會降解

使用丙酮或氯仿，腔室的硅樹脂膜可能會略微膨脹；甲醇則沒有問題，可以觀察到將細(xì)胞平面?zhèn)确旁谏w玻片上的良好圖像。

取材

待細(xì)胞拉伸結(jié)束，可使用手術(shù)刀或類似工具切下一塊PDMS，保持包被涂層和細(xì)胞仍在其上。建議將膜切成矩形，以識別拉伸方向，避免用標(biāo)簽等損害樣品質(zhì)量。

準(zhǔn)備好膜后，將其細(xì)胞面朝下放置在載玻片上，并使用封裝介質(zhì)，如PermaFluor™封片劑。

熒光染色步驟

滲透：通常使用溫和的表面活性劑溶解細(xì)胞膜，以允許較大的染料分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

固定：用于在制備過程中保存細(xì)胞或組織形態(tài)。大多數(shù)固定程序都需要添加化學(xué)固定劑，可以在蛋白質(zhì)之間形成化學(xué)鍵，以增加蛋白質(zhì)的剛性。常見的固定劑包括甲醛、乙醇、甲醇等。

安裝：將樣品附著到載玻片上進(jìn)行觀察和分析。細(xì)胞可以直接生長到載玻片上，也可以使用無菌技術(shù)將松散細(xì)胞轉(zhuǎn)移到載玻片。組織材料的切片也可以應(yīng)用于顯微鏡載玻片以進(jìn)行觀察。

染色：對樣本進(jìn)行染色，以使細(xì)胞、組織、成分或代謝過程著色。該過程可能涉及將樣品浸入染料溶液中，然后沖洗并在顯微鏡下觀察樣品。有些染料需要使用媒染劑——與染料反應(yīng)形成不溶性有色沉淀的化學(xué)化合物。當(dāng)過量的染料溶液被洗掉時(shí)，媒染的印記會留在樣品上。